Cazando fármacos Tratamientos para VPH

II.a Drescripción molecular

El VPH es un virus relativamente pequeño (Figura 2) , que contiene un ADN de doble cadena asociado con proteínas similares a las histonas y protegido por una cápside con simetría del icosaedro, no presenta envoltura y mide entre 60 nm de diámetro está constituida por 72 capsómeros pentámericos de la proteína más abundante (L1) en un arreglo con número de triangulación (T) de 7 , otra proteína de la cápside denominada L2 se asocia con un subgrupo de capsómeros formados por L1 (Santos, et al 2015).

Figura 2. VPH a nivel molecular

A pesar de que la familia del virus del papiloma representa un grupo de virus notablemente heterogéneo, comparten de forma similar su estructura y organización del genoma (Figura 3) contiene aproximadamente 8000 pb y alberga un promedio de ocho marcos de lectura abiertos, dividido en tres regiones.

La región temprana (E) codifica genes que son necesarios para el ciclo viral y con un papel importante en la transformación celular (E1, E2, E4, E5, E6 y E7).

La región tardía (L) codifica las proteínas de la cápside L1 y L2.

La región larga de control (LCR), es una región no codificante que contiene el origen de replicación y sitios de unión al factor de transcripción que contribuyen a regular la replicación del ADN controlando el virus, transcripción de genes. E6 y E7, junto con E1, E2, E4 y E5, son esenciales para el genoma viral, replicación y síntesis y liberación de viriones, pero también juegan un papel clave en la transformación celular (San José & Brotons y Pavón, 2018) (Figura 4).

II.b Ciclo replicativo

Los virus de papiloma humano pueden ingresar al cuerpo a través de lesiones o microabrasiones debido a su alta especificidad por las células epiteliales y en estas células es donde se lleva a cabo la síntesis de partículas virales.

La introducción de los viriones en la célula se realiza gracias a la interacción entre la proteína L1 de la cápside del virus y el sulfato de heparina o el receptor sindecano 3 en la membrana celular. Ambos, el sulfato de heparina y el receptor sindecano 3, son glucoproteínas presentes en el tejido de mamíferos y con funciones biológicas de unión a proteínas para regular procesos biológicos. En esta interacción se produce un cambio conformacional en la cápside del virus, permitiendo su endocitosis, esta internalización puede tomar de 2 a 4 horas. Además, se tienen indicios de la participación de la proteína nexina 17 que provoca una inhibición en la ruta de la cápside hacia los lisosomas, evitando la degradación del virus.

Posteriormente, se produce un desprendimiento parcial de la proteína L1 en el endosoma de la célula, liberando al genoma y a la proteína L2, permitiendo su migración hacia el núcleo por el citoplasma en asociación con la dineína (Knipe y Howley, 2007).

Una vez dentro del núcleo, el genoma es transcrito en una serie de procesos complejos, iniciando con la expresión de las proteínas E1 y E2 que se mantienen entre 20 y 100 copias por célula, creando un control en el número de copias del genoma viral (Santos, et al 2015). El complejo formado por las proteínas E1-E2 recluta a la maquinaria celular para la replicación del genoma, induciendo la proliferación de los virus en las células e incrementando el número de células susceptibles a ser infectadas. Por su parte, la expresión de las proteínas E5, E6 y E7 propician que la infección continúe y en VPH de altos riesgos las proteínas E6 y E7 están asociados a la degradación de proteínas supresoras de tumores, propiciando el desarrollo de cáncer.

Finalmente, la proteína E4 regula la expresión de los genes L1 y L2 para la cápside y ensamble de los viriones. También participa en la maduración viral y en la salida de los viriones (Santos, et al 2015). Sin embargo, una característica importante de los virus de alto riesgo es que su genoma se integra al genoma de la célula, conllevando a lesión de cáncer invasivo (Santos, et al 2015).

II.c Tipos de VPH

En los tipos de VPH, cada genotipo del virus difiere de otro en al menos un 10% de diferencia en su secuencia se han definido grupos de genotipos evolutivos del VPH (α, β, γ, μ y ν) el grupo más grande es α han sido divididos en grupos de alto y bajo riesgo. Los genotipos del VPH que afectan las mucosas, se transmiten por vía sexual y se clasifican como de bajo y alto riesgo (Graham, 2017). Los virus de bajo riesgo, como los VPH 6, 11, 40, 42, 43,44, 54, 61, 72 y 81, se asocian con el condiloma acuminado, la neoplasia intraepitelial de bajo grado y las infecciones asintomáticas. Se han identificado 15 tipos virales de alto riesgo(oncógenos) asociados con el CaCu (Cáncer cervicouterino) y con la neoplasia intraepitelial cervical de alto grado, los más comunes son los VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58 y 59 (Ochoa, 2014).

En México, los cuatro VPH más frecuentes relacionados con cáncer cervical son el VPH 16, 18, 45 y 31 por orden de frecuencia (Gráfica 2). Es importante mencionar que a nivel mundial los VPH 16 y 18 destacan por ser agresivos; sin embargo, después de ellos la prevalencia de tipo de VPH y el cáncer cervical cambia geográficamente.

Gráfico 2. Prevalencia de VPH en México y lesiones en mujeres

Fuente: Elaboración propia a partir de Human papillomavirus and related diseases report. L'Hospitalet de Llobregat: ICO Information Centre on HPV and Cancer

A partir de los datos observados en la gráfica donde se muestra que los VPH 31 y 45 son de gran importancia médica y del análisis del ciclo de reproducción del virus, decidimos aplicar nuestros conocimientos sobre docking de proteínas para buscar posibles fármacos que tuvieran interacción con dos de las proteínas más importantes para el ciclo viral. La proteína E2 Y E7

III.a Conociendo al Docking

Anteriormente, la síntesis de nuevos compuestos con efecto farmacológico terapéutico se daba a través de la ruta de los compuestos supuestos con la propiedad de interés o el cribado de productos naturales lo que llevaba a exploraciones aleatorias o al azar. Actualmente, las herramientas computacionales han evolucionado, transformádose en tecnologías de importancia para el descubrimiento de nuevos fármacos mediante la selección de moléculas llamadas “cabezas de serie” o “leads” a partir de bases de datos, el modelado molecular forma parte de estas herramientas esta técnica permite obtener moléculas (reales o virtuales). Aunado a lo anterior, estas herramientas dan la posibilidad de exhibir una acción específica y hace posible predecir su biodisponibilidad y su toxicidad (Velásquez et al, 2013).

Entre estas novedosas técnicas se encuentra el acoplamiento molecular (docking), con ella podemos predecir la estructura de los complejos intermoleculares que se establecen entre dos o más moléculas. En esta técnica se ha ha estudiado, principalmente, la interacción proteína–ligando, cuyo objetivo principal es predecir energías y modos de enlace, y que suele hacerse previamente a un estudio experimental (Velásquez et al, 2013).Por ello, en este proyecto sirvió como la técnica ideal para encontrar moléculas candidatas a fármacos terapéuticos contra el VPH.

III.b Proteínas E2 y E7

Proteína E2

Tipo de VPH: 11

ID Protein Data Bank: 1R6N

Función:

Actualmente se sabe que una carga viral de 50 a 100 copias por célula en un tiempo prolongado es necesaria para que la infección continúe y, además, está asociada con el desarrollo de cáncer. La proteína E2 (Figura 5) es esencial para este proceso, pues permite la replicación del genoma del VPH al unirse sitio de origen de replicación y reclutar proteínas E1 con actividad helicasa. Las proteínas E1 forman complejos de doce unidades que separan las hebras de ADN del VPH e interaccionan con la maquinaria de replicación del hospedero para iniciar la replicación. Por lo tanto, si se logra impedir la unión, de E2 y E1, la replicación del virus y, por último, la infección

Para este trabajo se considerará el dominio de transactivación de la proteína E2 del VPH 11; es decir, el dominio que se une a la proteína E1. A pesar de que se usará un VPH diferente al 31 y 45, que son de nuestro interés, se ha encontrado que este dominio esta muy conservado entre los VPH (McBride, 2013). Por lo tanto, se espera que este dominio sirva en este trabajo.

En la figura 5 se observa la proteína E2 del tipo VPH con los aminoácidos que se conoce interaccionan con la proteína E1 y con posibles tratamientos (Fradet-Turcotte & Archambault,2007).

Figura 5. Proteína E2 con aminoácidos relevantes

Proteína E7

Tipo de VPH: 45

ID Protein Data Bank: 2EWL

Función:

Durante el ciclo de vida normal del virus, estas proteínas propician un ambiente favorable para la replicación viral. Sin embargo, en VPH de alto riesgo se une a la familia de promotores supresora de tumores pRb, promoviendo su degradación, esta característica es fundamental para dotarla de sus propiedades oncogénicas. Así, si se logra desregular la función de unirse a la proteína pRb se lograría inhibir las propiedades oncogénicas de E7.

Figura 6. Proteína E7

III.c Ligandos

Proteína E2

De revisión bibliográfica se encontró que la familia de fármacos provenientes de indandiona tiene la capacidad de inhibir la unión entre la proteína E2 y E1 (Figura 7), (Robert Pluskota & Marcin Koba, 2007).

Figura 7. Mecanismo de acción de indandionas en E2

A partir de esta información seleccionamos los siguientes fármacos para su prueba.

1-3 indandiona. Potente farmacóforo con algunas funciones como anticoagulante anticonvulsiva, anti-microbianas, anti-cáncer, anti-inflamatorios, anti -oxidative posee un núcleo aromático se ha vuelto vital por su capacidad en el desarrollo de fármacos bioconjugados.

Fenindiona. Impide la síntesis hepática de los factores del complejo protrombínico (II, VII, IX, X) al inhibir competitivamente a la enzima vitamina K reductasa mediante antagonismo con la Vitamina K. Impiden el transporte de Vitamina K hasta su sitio de acción.

Acenocumarol . Anticoagulante oral, adversario de la vitamina K , su función es impedir la activación de los factores de coagulación dependientes de la vitamina K (II, VII, IX y X) y las proteínas C y S.Esta indicado para prevenir afecciones tromboembólicas .

Proteína E7

De revisión bibliográfica se encontró un posible fármaco que podía actuar inhibienda la acción de la proteína E7.

Cisplastino. Medicamento usado en quimioterapia .

III.d Metodología

Proteína E2

Inicialmente se inento utilizal la plataforma Dockthor para realizar el docking; sin embargo, era probable que otros investigadores de CdCMx 2021 la estuvieran utilizando proque se encontraba saturada y no podíamos recibir los resultados en nuestro laboratorio. Entonces, comenzamos a explorar otras alternativas dentro de las que encontramos HDOCK SERVER, que fue la utilizada para este trabajo.

La metodología seguida se expone en el siguiente diagrama de flujo.

Diagrama de flujo para Docking en HDOCK SERVER

IV. a Modelos para E1

Para los modelos con E1 se encontró que los aminoácidos que interaccionaban y fueron predichos por Fradet-Turcotte y Archambault concordaban en la figura 5, mostrandonos que el docking que realizamos fue exitoso. Además, dentro de los aminoácidos que resultaron con una interacción constante a través de los fármacos fueron histidina 32, triptófano 33, leuncina 94 y treonina 97, pues se encontraron en todos los modelos para estas protéinas. Aunado a lo anterior, en las imagenes donde se aprecia la superficie de E1 podemos ver como los ligandos (fármaco) se acoplan con la forma de la proteína en una especie de modelo llave cerradura característica de las enzimas, esta observación nos puede dar más indicios sobre si fue correcto nuestro docking (Figura 8)

Figura 8. Modelos para E2

IV. a Modelos para E7

Por otro lado, para el modelo de E7 se encontró que el modelo no se ajusto como en E2. Es probable que se deba a que el ligando no interacciona muy fuertemente con esta proteína. Sin embargo, analizar los resultados más profundamente sería recomendable (Figura 9)

Figura 9. Modelos para E7

Como siguiente paso se propone el uso de Protein-Ligand Interaction Profiler para conocer más detalladamente las interacciones encontradas

Nota: Todas las gráficas, figuras y diagramas fueron realizados por las autoras. Para las gráficas se utilizó RStudio, para las figuras de proteínas se utlizó Chimera 1.15 y para las figuras restantes BioRender